学术交流 | 在Western blot实验中那些你必须知道的坑

作为生物研究中最为常见的蛋白印迹实验Western blot(简称WB)，也是细节满满，可谓小实验里有大文章。正所谓“WB虐我千百遍，我待WB如初恋”。WB操作时间很长，所以每一步都有可能出错。尽管绝大多数人在操作WB时都会被虐成渣渣，却也依然在和WB斗志斗勇的过程中积累了丰富的经验；前人种树，后人乘凉嘛。今天半岛就把各位江湖前辈做WB的血泪史总结起来，希望对大家有所帮助。

WB简介

Western印迹法(Western blot)或称“蛋白质转渍法”、“免疫印迹法”(Immunoblot)或“西式吸印杂交”，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，也是HIV检测的方法之一。该方法在电场的作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测，经常用于目的蛋白的表达量分析、组织定位、表达特性分析及与其它蛋白的互作。发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克(George Stark)。在尼尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)中首次被称为“Western印迹法”。如下的段落里，我们将以动物细胞为例，逐一讲解实验流程、遇到问题及解决办法。

A蛋白定量及配制样品

1、收取细胞的时候，一般是用PBS冲两遍，如果PBS没有吸干净，可能会导致蛋白浓度过低。

2、 利用超声技术破碎细胞的时候，因为超声发热损伤蛋白，一般会把要超声的样本放到冰水混合物里，如果超声的时候有冰块掉进去的话，也会导致蛋白浓度过低。

3、蛋白测浓度前，将BSA浓度从5 mg/ml按梯度递减配到1 mg/ml，如果做蛋白定量时每次蛋白浓度都低于最小值，那很有可能就是BSA浓度没有稀释到位，导致最后的蛋白浓度小于最小值。

4、提取出某蛋白进行第一次检测，因为不知道其表达量如何，可以减少裂解液的添加量(这样蛋白浓度高一些)，加大上样量，并在后续过程中增加抗体浓度，以期提升成功率。否则，得不到结果时不知道是因为蛋白量太小还是抗体不适合等其它条件的影响。得到结果后，根据信号条带的亮度调整各种试剂的用量。

5、制样煮蛋白时一定要将盖子扣紧，最好是用进口的EP管，不然的话EP管崩掉就没有定量的意义了。

B电泳跑胶

一、配胶

1、如果是冬天，可以把胶放到37 ℃温箱里来节省胶凝固的时间。夏季配胶时要注意温度影响，在灌注浓缩胶之后要立即插上梳子，避免上层胶凝固。

2、 梳子注意选好1 mm和1.5 mm的玻璃板，1.5 mm的梳子插不进去1mm的玻板；但是如果1 mm的梳子插到了1.5 mm的玻板里，由于凝胶与梳子中间有空隙，上样会漂。

3、同时注意胶的浓度：分离80~140 kd的蛋白多用8%的胶，25~80 kd的用10%，15~40 kd的用12%，＜20kd的用15%。

4、频繁做WB时，可以一次可以多配几块电泳胶及running buffer 在4 ℃保存，省的每次配胶。

二、上样

根据蛋白表达水平调整蛋白上样量，保证每孔上样量保持一致。

1、上样时一定注意不要配错buffer！任何一个成分及浓度搞错，都会导致跑胶异常，浪费了宝贵的样本。

2、电泳槽的内槽，上完样后记得加满buffer。如果running buffer加不满，就可能会导致不通电，很多时候蛋白跑到一半，就会停住不动了。

3、千万不要暴力拔梳子！上层胶凝固后就可以泡到running buffer里，否则会导致梳子不太好拔。如果暴力拔梳子，会导致凝胶破损甚至玻璃板破裂。

4、上样时marker尽量不要放在中间，放在两边作为顺序的标记。

5、在电泳跑胶后如不能立即转膜，避免将胶块长时间放在running buffer里面，而应该放在transfer buffer里固定(里面有甲醛，可固定蛋白)。在没有电流的作用下，胶块内蛋白未被固定，会发生扩散，转完膜后信号条带难看。

C转膜

转膜方法可分为湿转法和半干法。需要注意：

1、 Transfer buffer一定要配制正确，并且务必要分清running buffer 和transfer buffer。一个简便区分办法，transfer buffer里没有SDS，转膜时没有气泡。

2、转膜时务必要夹紧夹板，可采用“三明治”型滤纸加海绵结构，要拧紧一点。可以增加海绵的厚度，也可以多加两块海绵，但是多加滤纸的时候要小心，因为不同滤纸的质地和材质不一样，可能会导致电阻比较大，需要延长转膜时间才可以(这个需要前期摸索，在增加滤纸之前要去网上查一下)。

3、夹三明治转膜结构的时候可以多加transfer buffer，要没过胶和膜，这样有助于减少气泡，提高转膜效率。

4、注意转膜温度的控制，可以提前将transfer buffer放到4℃冰箱，等到用的时候取出来。转膜过程中，尤其是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，需要在转膜盒外围加冰水混合物。如果觉得天气太热冰容易融化的话，还可以放冻好的冰袋，一般这样就可以保证转膜的时候transfer buffer不会发烫。

5、配置转膜液的时候，记住甲醇浓度20%。

6、胶在负极，膜靠近正极；转膜的时候，海绵要比滤纸大，滤纸要比胶块大，PVDF膜或硝酸纤维素NC膜要比胶块大，但都不要超过海绵；比对胶块中上样顺序，在膜上做好标记，便于后续分析结果。

7、注意一定要戴手套或塑料镊子接触膜，避免手上的蛋白和油脂降低转膜效率。

8、对于湿转法：一般转膜的电流在200 mA-400 mA之间，转膜时间为30-60 分钟。也可以在15-20 mA电流中转膜过夜。大片段的>50 KD的可以选用350 mA电流，小片段的可以用250 mA。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

D 封闭与一抗二抗孵育

1、常见的封闭液有5%脱脂奶粉、BSA和Western Blot膜封闭液(生物试剂公司提供)。但是封闭液的选取具体得看抗体说明书，有的抗体是明确要求只能用BSA，而封闭液浓度的选择也是具体得看抗体的要求，但是一般情况5% BSA会比5% 牛奶的效果好。做磷酸化蛋白检测，尽量使用BSA可以降低背景。

2、孵育抗体使用的盒子务必清洗干净，防止油脂等杂物沾到膜上，造成非特异信号。

3、选择抗体时，需要考虑：a，选好品牌，注意购买渠道；b，验证产品数据是否完善，是否明确标注可以用于Western Blot实验，是否有足够的数据支持证明该抗体适用于某一组织或者样本，是否明确建议稀释浓度、该抗体的识别位点是连续的氨基酸序列的一级结构还是非连续性氨基酸的三维结构位点；c，准备好有效的内参抗体。

4、如果一次性需要检测多个蛋白，电泳后可根据marker将膜剪开，分别用不同的抗体孵育，进而一次实验检测多个蛋白。当两个蛋白分子量很相近，PVDF膜无法剪开时，可先曝光表达弱的蛋白，再用抗体洗脱液将已结合的一抗、二抗洗去，随后曝光表达强的蛋白。这样一张膜可以多次使用，但需注意的是该方法由于抗体洗脱液剧烈处理，可能会丢失某些信号。

5、买一个抗体孵育槽可以节省抗体的使用量，每个小槽可以孵一张膜(土豪实验室可自行忽略本条)。

E 显影

1、显影液、定影液可以从公司购买显影粉和定影粉，加水溶解制备。需在不透光的暗室操作，避免实验室温度过高。也可用Bio-rad凝胶成像系统照相，选择不同的曝光时间成像。

2、将显影液均匀覆盖到膜上。在压片的时候，膜要用保鲜膜包住再放上底片，底片和膜不能直接接触。如果显影液是超敏的，可以考虑稀释一下，曝膜的时候从毫秒开始起曝，不然过曝了就没有意义了。

3、内参一般比较灵敏，有时候显影会连成一条线。这时可尝试减少上样量。

小结

道路千万条，靠谱第一条，操作不规范，WB就完蛋！

北京半岛提醒您：世间最远的路莫过于WB给你的套路，了解实验背后的原理，就可以知道我们所做的每一步是否正确，是否还有挽救的余地。天下万物相通，实验亦是如此，致广大奋斗在实验室的同胞们，同时与诸君共勉，希望大家都能获得漂亮的结果！

附件：在WESTERN BLOT实验中那些你必须知道的坑